Что такое пцр исследование. Как собрать биоматериал для диагностики

к.б.н. Покровская М.С.,
чл.-корр. РАМН, проф. Смирнов Г.Б.
(НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН и АО «ЛАГИС»)

Введение

Давно и хорошо известно, что для того, чтобы вылечить больного, нужно знать, чем именно он болен. Процесс определения типа болезни называется диагностикой. Диагноз при любой болезни ставит врач (на основании изучения анамнеза, наблюдения клинических проявлений и анализа данных лабораторных исследований), после чего назначает лечение. В наши дни при постановке диагноза врач использует данные лабораторных исследований, без которых поставить правильный диагноз либо затруднительно, либо в ряде случаев вообще невозможно.

Значение диагностики как процесса распознавания болезней состоит в том, что ранний, точный диагноз является основой для проведения рациональной и эффективной терапии, позволяет в большинстве случаев предсказать возможные варианты дальнейшего течения и исхода заболевания.

При диагностике инфекционных болезней, в т.ч. ЗППП важно выявить этиологический фактор (возбудителя) и установить стадию заболевания, то есть получить сведения необходимые для выбора этиотропной и адекватной терапии, предсказать ход болезни и сроки её завершения.

Характерными чертами современной лабораторной диагностики являются постоянная разработка новых и совершенствование известных методов и приёмов. Это обусловлено тем, что в последние десятилетия наблюдается непрерывное изменение как клинической картины инфекционных заболеваний, так и особенностей их патогенеза. Например, известные достаточно опасные возбудители могут вызывать стёртые формы болезней или наоборот: условно-патогенные или считавшиеся непатогенными микроорганизмы становятся причиной тяжелых форм. Меняется тропность патогенных микроорганизмов (поражают другие органы и ткани) и, как следствие, появляются новые формы инфекционных процессов. Возникают хронические, персистирующие формы инфекций и изменяется антигенная структура возбудителей, микроорганизмы переходят в некультивируемой состояние. Отклонения от классических форм протекания инфекционных заболеваний и возникновение атипичных форм связаны с двумя обстоятельствами. Во-первых, у части населения изменилось состояние иммунной системы, стали распространенными иммунодефицитные состояния различной природы. Во-вторых, меняются сами возбудители инфекций. То есть, мы являемся свидетелями эволюционного процесса у микроорганизмов.

Все это затрудняет диагностику и отрицательно сказывается на эффективности лечения. Роль использования современных методов лабораторных исследований для постановки диагноза становится в настоящее время весьма значительной.

Для диагностики инфекционных болезней используются различные лабораторно-инструментальные методы, среди которых важнейшее место занимают специфические методы, имеющие целью выявить возбудителя заболевания и установить, таким образом, этиологический диагноз.

Предметом данного сообщения являются избранные разделы лабораторной диагностики инфекционных болезней.

Основные понятия и методы лабораторной диагностики инфекций

Ключевыми показателями лабораторной диагностики являются чувствительность и специфичность методов выявления возбудителей инфекций (грибов, простейших, бактерий и вирусов).

Чувствительность - это минимальное количество материала, которое можно выявить данным методом. Материалом могут быть целые микроорганизмы и фрагменты молекул возбудителей, а также специфические антитела, выработанные человеческим организмом в ответ на инфекцию. Чем меньше материала способен выявить метод, тем выше его чувствительность. Если лабораторное исследование не выявляет микрорганизмы, которые присутствуют в образце и для выявления которых разработана тест-система, результат называется ложно-отрицательным. Чем выше чувствительность метода, тем меньше ложно-отрицательных [ложно(-)] результатов.
Специфичность - это способность метода указывать на наличие в образце только того объекта, для выявления которого была разработана тест-система. Если метод указывает на наличие в образце микроорганизмов, которые там не содержатся, результат называется ложно-положительным. Чем выше специфичность метода, тем меньше ложно-положительных [ложно (+)] результатов.
Все методы лабораторной диагностики можно разделить на две группы: методы прямого и непрямого выявления микроорганизмов.

Прямые методы названы так потому, что выявляют непосредственно возбудителей инфекций или материал, входящий в состав возбудителя, или им продуцируемый. Обычно это антигены или генетический материал. К числу прямых методов относятся следующие (табл. 1):

Таблица 1. Прямые методы лабораторной диагностики
Методы	Принцип метода	Специфичность	Чувствительность
Микробиологический	Выделение чистой культуры возбудителя	100% “золотой стандарт” лабораторной диагностики	1 000-10 000 кл/ мл
Цитологический (микроскопия)	Исследование окрашенных мазков	20-80%	1 000-100 000 кл/ мл
Иммуноцитологический и серологический	Выявление антигенов после связывания с антителами РИФ, ИФА	70-90%	1 000-100 000 кл/ мл
Молекулярно-биологический	Определение специфического участка ДНК/ РНК в геноме возбудителя	99-100% приравнивается к “золотому стандарту”	200 кл/мл (1 клетка в реакции)

Ложно(+) результаты связаны в случае цитологического метода с субъективностью оценки результатов, в случае иммунологических методов - с перекрестным реагированием антигенов с антителами.

Ложно(-) результаты в прямых методах могут быть обусловлены недоступностью возбудителя во время забора клинического материала, для микробиологического метода - гибелью микроорганизма в процессе транспортировки образца и в случае некультивируемой формы.

Непрямые методы названы так потому, что выявляют материал не самого возбудителя, а специфические антитела, выработанные человеком в ответ на инфекцию данного типа, т.е. являются иммунологическими. К таким методам относятся: реакция связывания комплимента (РСК), реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ), реакция микроиммунофлуорес ценции (МИФ), рекомбинантный липополисахаридный ИФА (r - ELISA), иммуноферментный анализ (ИФА). Чувствительность этих методов - 1000-100000 кл/мл.
При использовании иммунологических методов практически во всех случаях ложно(+) результаты связаны с неспецифическим связыванием антител с антигенами или перекрёстным реагированием антигенов с антителами. Ложно(-) результаты возникают из-за недостаточного количества специфических антител или антигенов в пробе и недостаточной чувствительности методов определения.

Несмотря на значительные успехи современной лабораторной диагностикой ни один метод на практике не гарантирует сочетания 100% чувствительности и специфичности. А значит не дает 100% верного ответа. Поэтому для постановки диагноза врачу нередко необходимо использовать минимум два различных метода, причем каждое исследование лучше проводить в двух- или трёхкратном повторении. Это является требованием при диагностике таких болезней, как туберкулёз, хламидиоз и ряда других (1).

Диагностическое значение выявления иммуноглобулинов классов А, М, G

Остановимся подробнее на серологической диагностике (определение антител в сыворотке крови методом ИФА). Она основывается на определении очень специфических антител (АТ), образующихся в организме человека в ответ на присутствие микроорганизмов - возбудителей инфекций. Эти АТ представляют собой иммуноглобулины (Ig) классов М, А, G. Антитела нейтрализуют инфекционные агенты, взаимодействуя с антигенами. Антиген - это специфическая часть инфекционного агента (микроорганизма), которая вызывает в человеческом организме образование специфических антител (иммунный ответ). Основой серологических реакций является специфическое взаимодействие антиген-антитело. Рассмотрим, что дает для постановки диагноза выявление АТ классов IgM, IgA, IgG (Табл. 2).

Таблица 2. Определение стадии инфекционного заболевания по результатам исследования антител в сыворотке крови методом ИФА
Стадия (форма) заболевания	Антитела в порядке появления в сыворотке крови	Динамика титров (в интервале 2-3 недели)
Острая при первичном инфицировании	IgM ⇒ IgG ⇒ IgA или - IgM ⇒ IgA ⇒ IgG ⇒ ранние или предранние IgG	Нарастание титров или снижение (IgM после 7-го дня), - в зависимости от времени, прошедшего с начала развития инфекции
Вторичное инфицирование и реактивация (рецидив)	IgG ⇒ IgA, почти полное отсутствие IgM ⇒ ранние или предранние IgG	Быстрое нарастание или снижение титров
Хроническая	IgG ⇒ IgA, иногда только IgA или только IgG	Постоянные невысокие титры, могут быть постоянно высокими - в случае тяжелой восходящей инфекции или системных поражений.
Персистенция, носительство	IgA или IgG	Постоянные (несколько недель) низкие титры (АТ не всегда выявляются из-за изменённой антигенной структуры микроорганизмов)
Давно перенесённая болезнь	IgG	Стабильно низкие титры

Количественное определение антител различных классов помогает определить стадию и характер течения заболевания. При трактовке количественных результатов необходимо учитывать, что иммунный ответ человеческого организма на развитие инфекции и уровень вырабатываемых им антител зависят от особенностей возбудителей, стадии инфекционного процесса и индивидуальных особенностей иммунной системы. В случае выраженной иммуносупрессии синтез АТ может быть полностью подавлен. Поэтому для постановки диагноза, особенно при атипичных формах протекания инфекций, врач не может однозначно трактовать количественный результат одного исследования.

Для правильной оценки результатов количественного выявления антител к различным инфекционным агентам необходимо пользоваться принципом парных сывороток (повторение исследования через 2-3 недели и сравнение результатов). Такие исследования дают возможность проанализировать динамику выявления антител и, таким образом, получить необходимую информацию о развитии инфекционного процесса. Четырехкратное нарастание антител за 2-3 недели свидетельствует о развитии инфекции.

Именно для того, чтобы была возможность провести такие парные исследования и нужны количественные результаты ИФА.

Традиционный путь определения острой инфекции - выявление в сыворотке крови IgM. Современные диагностические тест - системы позволяют выявлять кроме IgM другие ранние антитела, такие как: 1) IgG к предранним белкам вирусов и 2) низкоавидные IgG. Причем IgG к предранним белкам вирусов являются маркерами как первичной острой инфекции, так и рецидива (обострения хронической инфекции) и реинфекции, т.е. всех вариантов острой инфекции, в отличие от IgM, вырабатывающихся, как правило, только при первичной инфекции.

Полимеразная цепная реакция

Введение в практику медицинской микробиологии молекулярных методов диагностики стало, безусловно, знаменательным событием, так как оно радикально расширило возможности изучения патогенеза заболеваний, принципиально усовершенствовало диагностику и даже обозначило новые подходы к лечению. Всё более распространённым становится метод молекулярной диагностики, основанный на ПЦР, дающей оптимальное сочетание высокой чувствительности и специфичности.

Молекулярная диагностика, вообще, и ПЦР в частности, основаны на определении наличия в исследуемом образце специфических нуклеиновых кислот, чаще всего ДНК.

ДНК - двунитевая (двуцепочечная) полимерная молекула, последовательность нуклеотидов в которой и определяет все свойства организма. При делении клеток ДНК удваивается, и в каждую из двух дочерних клеток попадает точная копия генетического материала родительской клетки. Удвоение молекулы ДНК называется репликацией. На двух исходных (матричных) цепях ДНК строятся новые дочерние цепи (комплементарные матричным). Репликация обеспечивается ферментативным комплексом, ключевым элементом которого является ДНК-полимераза. Для того, чтобы ДНК-полимераза сумела начать репликацию ей, помимо матрицы, необходима затравка (праймер) - небольшой фрагмент ДНК, комплементарно связанный с матрицей. Эту затравку ДНК-полимераза как бы удлиняет, строя новую цепь ДНК на имеющейся матрице. В норме в природе реплицируется вся ДНК, находящаяся в клетке или вирусе, и продуктом этого процесса являются две идентичные копии исходной ДНК.

Теперь, когда мы вкратце вспомнили самое главное о репликации, можно перейти к описанию полимеразной цепной реакции. ПЦР была открыта в 1983 году и в настоящее время широко применяется для научных и практических исследований, в области диагностики инфекционных и генетических заболеваний, ранней диагностики некоторых онкологических патологий. За открытие этого метода Кэри Мюллис в 1995 году был награжден самой престижной научной наградой - Нобелевской премией.

В ходе этой реакции тоже реплицируется ДНК, но не так, как обычно в природе. Во-первых, реплицируется не вся ДНК микроорганизма, а только ее небольшой фрагмент (мишень).

Во-вторых, продуктом ПЦР являются не две, а миллионы копий исходной мишени. Такая многократная репликация называется амплификацией.

У разных родов и видов бактерий, а также у вирусов, генетические тексты (нуклеотидные последовательности ДНК) различаются. Современные компьютерные программы содержат банк данных о расшифрованных последовательностях ДНК различных организмов. При разработке диагностической ПЦР-тест-системы находят небольшой фрагмент ДНК (мишень), строго специфичный для конкретного возбудителя. С помощью ПЦР амплифицируют именно этот участок и затем идентифицируют продукт амплификации (ампликон) методом электрофореза в агарозном геле.

Выявляя специфический для данного микроорганизма фрагмент ДНК, тем самым определяют микроорганизм.

Каждый цикл диагностики инфекций проходит в три стадии (рис.):

Денатурация - расплетение цепей двунитевой ДНК - не ферментативный процесс, который идет при температуре 95 0 С.
Присоединение (отжиг) праймеров. Для начала процесса репликации в ПЦР используют праймеры - короткие одноцепочечные ДНК (длиной 15-30 оснований), которые добавляют в избытке в реакционную смесь. Они специфично (по принципу комплементарного спаривания) присоединяются к коротким участкам, ограничивающим выбранную мишень. Эта стадия не является ферментативной и проходит в процессе инкубации реакционной смеси при 55-65 0 С. Праймеры присоединяются только к выбранным специфичным для данного возбудителя фрагментам ДНК и не взаимодействуют ни с какими другими последовательностями ДНК (а в клинической пробе очень много ДНК, как человека, так и различных микроорганизмов). Именно этим обеспечивается абсолютная специфичность диагностической ПЦР-тест-системы. Избыточное количество ДНК праймеров по отношению к матричной ДНК обеспечивает высокую чувствительность метода. То есть праймеры в исходном для ПЦР растворе со 100% вероятностью найдут мишень для присоединения.
В результате присоединения праймеров образуются структуры [ДНК-матрица + праймер], являющиеся «затравочными» комплексами. Начинается достраивание праймеров, начиная с 3’-концов, путём комплементарного синтеза на матрицах одноцепочечных фрагментов ДНК. Этот процесс осуществляется с помощью специального фермента - Taq-полимеразы (термоустойчивой ДНК-полимеразы) и нуклеотидов (в качестве строительного материала).
Вновь синтезированные двуцепочечные ДНК после стадии денатурации снова связывают праймеры, которые находятся в смеси в избытке . Полученные структуры после достраивания образуют специфические фрагменты ДНК, ограниченные последовательностями праймеров. Таким образом, даже если исходной для ПЦР была только одна молекула ДНК, то в течение 25 - 40 циклов происходит амплификация, т.е. синтезируется большое количество (108-109 копий) специфических фрагментов ДНК (ампликонов), достаточное для визуального учета результата реакции после электрофореза в агарозном геле.

ПЦР проводят в циклаторе или амплификаторе - приборе, в котором циклично автоматически выполняется заданный режим смены температур, позволяющий многократно последовательно проходить 1, 2, 3 стадии.

Учёт реакции проводят с помощью электрофореза в агарозном геле. Отрицательно заряженные молекулы ДНК движутся в геле под действием электрического поля от катода к аноду, при этом длина пробега фрагментов ДНК за определенный промежуток времени зависит от их размера. ДНК в геле окрашивают бромидом этидия, что делает ее видимой в ультрафиолетовом свете. Если в исследуемой пробе в результате ПЦР накопились ампликоны (фрагменты ДНК одинакового размера), то они окажутся на одном расстоянии от старта и будут видны как полоса на гелевой дорожке. Если положение полосы на гелевой дорожке соответствует расчётной для использованной пары праймеров, т.е. находится на том же расстоянии от старта, что полоса положительного контроля, то это означает, что результат исследования положительный.

Как и в каждом эксперименте при учёте результатов ПЦР предусматривают контроли - положительный и отрицательный. Любая диагностическая тест-система должна иметь утверждённый регламент, который включает наличие упомянутых контролей.

Положительный контроль - это образец с ДНК-матрицей для накапливания специфического ампликона, соответствующего определяемому микроорганизму.

Отрицательный контроль - вода, ДНК человека или ДНК микроорганизмов, близкородственных определяемому данной тест-системой.

Достоинства метода ПЦР

ПЦР диагностика является одним из наиболее современных и совершенных лабораторных диагностических методов, позволяющий специфично выявлять ДНК единичных клеток возбудителей инфекционных заболеваний в образце.

Есть принципиальное отличие методов молекулярной диагностики, включая ПЦР, от любых других традиционных методов. Это отличие состоит в том, что традиционные методы выявляют продукты деятельности генов микроорганизмов (белки, антигены и более сложно организованные признаки), тогда как ПЦР выявляет непосредственно генетический материал. Таким образом, микроорганизм обнаруживается методом ПЦР в независимости от особенностей функционирования генома, каких-то атипичных проявлений.

Можно сказать, что ПЦР достигает предельно возможной чувствительности. Чувствительность ПЦР-тест-систем составляет 10-1000 клеток в пробе, в то время как чувствительность иммунологических и микроскопических методов - 1000-100000 клеток в пробе. Благодаря высокой чувствительности, тест-системы на основе ПЦР незаменимы в тех случаях, когда исследуемого материала (возбудителя заболевания) очень мало.

Благодаря высокой чувствительности исследование методом ПЦР позволяет осуществлять раннюю диагностику заболеваний (например, во время профилактических осмотров населения), уточнять диагноз на фоне антибиотикотерапии, проверять излеченность (эффективность проведенного лечения), а также обнаруживать персистирующие микрорганизмы. Для некоторых возбудителей, таких как Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, чувствительность диагностических ПЦР-тест-систем не должна быть высокой. Специально разрабатываются и утверждаются показатели чувствительности, начиная с 105-6 клеток в мл. Такие тест-системы выявляют диагностически значимое количество этих микроорганизмов (2,3).

При выявлении трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм патогенных микроорганизмов только прямой метод, выявляющий ДНК возбудителя, дает необходимый диагностический ответ. Другие способы диагностики (иммунологические, бактериологические, микроскопические) затруднены или даже невозможны. В случае персистирующих микроорганизмов это может быть связано с изменениями в антигенной структуре возбудителей или с переходом таких микроорганизмов в некультивируемую форму. Об этом необходимо помнить при диагностике латентных и хронических инфекций.

Высокая специфичность метода ПЦР задается нуклеотидной последовательностью праймеров и специально отрабатываемыми при создании ПЦР-тест-системы условиями их присоединения к специфическому строго для данного возбудителя фрагменту ДНК (мишени). В зависимости от выбранных праймеров ПЦР-тест-система может дифференцировать роды, виды, серотипы и даже патогенные и непатогенные штаммы микроорганизмов одного вида.

С помощью ПЦР диагностики инфекций можно определять чувствительность (или устойчивость) возбудителей ко многим из применяемых антибиотикам. Это особенно актуально в тех случаях, когда микробиологический метод исследования применить невозможно.

Для ПЦР-анализа пригоден любой клинический материал, потенциально содержащий возбудителей инфекций - кровь, сыворотка, лаважная жидкость, мокрота, слюна, желудочный сок, биопсийный материал, мазки, смывы. Исследуемым материалом могут быть пробы с объектов внешней среды (смывы, отпечатки, мазки, вода, почва и т.д.).

ПЦР является унифицированным и автоматизированным методом, что позволяет стандартно выдерживать регламент, утвержденный в разрешительных документах к использованию данной ПЦР-тест-системы и обеспечивает высокую точность и воспроизводимость результатов.

Лабораторная диагностика методом ПЦР - быстрый и надёжный способ выявления возбудителей инфекционных заболеваний. ПЦР-лаборатория даёт ответ через 48 часов с момента доставки материала на исследование. (Чистое время исследования каждого образца составляет всего несколько часов.)

В одном клиническом образце можно одновременно определять наличие более 20 возбудителей.

Важным аспектом при проведении исследования клинического образца является соблюдение правил забора и хранения клинического материала . Приведем здесь лишь некоторые общие рекомендации:

Забор клинического материала производится из предполагаемого места обитания микроорганизмов и развития инфекции (для этого необходимо учитывать входные ворота, пути распространения, места размножения и пути выделения искомых микроорганизмов).
Количество отделяемого в забранном материале должно быть небольшим (не больше, чем «со спичечную головку»). Избыток отделяемого, слизь и гной отрицательно влияют на качество выделения ДНК и способствуют деградации ДНК при хранении и транспортировке.
Для забора клинического материала необходимо пользоваться только одноразовыми щеточками или тампонами. При внесении клинического материала в лабораторную пробирку с раствором соблюдать стерильность.

Актуальность молекулярной диагностики

Одним из наиболее ярких примеров, демонстрирующих актуальность молекулярной диагностики, является выявление инфицированности папилломавирусами высокого онкогенного риска. Не все папилломавирусы вызывают злокачественный рост. Различают генотипы вирусов, вызывающие рак с большой вероятностью, и так называемые доброкачественные генотипы. К первым относятся генотипы 16, 18 (распространены в нашем регионе), 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 55, 56, 58, 59, 68 (ME180), MM4 (W13B), MM7 (P291), и MM9 (P238A). К доброкачественным относят генотипы 6, 11, 40, 42, 53, 54, 57, 66, и MM8 (P155). Идентификация генотипа папилломавирусов возможна и осуществляется с помощью ПЦР (4,5).

Папилломавирусы типов 16,18 персистируют в клетках плоского эпителия шейки матки, не вызывая клинических проявлений годами (до 5 лет инкубационный период), вплоть до момента образования заметных неоплазий. Ранняя диагностика в таких случаях возможна только при профилактических обследованиях населения с использованием ПЦР. В случае обнаружения ДНК папилломавирусов типов, вызывающих рак с большой вероятностью, пациенту следует обратиться к врачу онкологу, посещать его 1 раз в месяц, следить за клиническими проявлениями. Таким образом, ПЦР в этом случае даёт возможность осуществлять раннюю диагностику, позволяющую предотвратить или не запустить рак шейки матки.

В целом ряде случаев на определённых этапах заболевания возбудителей не удаётся выделить классическими микробиологическими методами. Это происходит в силу того, что микроорганизмы могут находиться внутри эпителиальных клеток, в тканях или слизи (например, для хламидий, микоплазм, уреаплазм, всех вирусов характерна внутриклеточная локализация, а трихомонады и гонококки могут находиться как внутри- так и внеклеточно). Кроме того, некоторые бактерии под влиянием определённых факторов могут переходить в так называемые некультивируемые формы или некультивируемое состояние. Примером может служить научно-медицинское исследование хламидиоза. Сравнивали продолжительность выявления Chlamydia trachomatis в очаге инфекции с помощью методов культуры тканей, прямой флуоресценции, ПЦР (выявление ДНК) и Вестерн-блота (выявление РНК). Установлено, что методы определения нуклеиновых кислот обнаруживают возбудителя в очаге на 4 недели дольше (16 недель против 12 недель после первичной инфекции), чем традиционные методы. В этой работе сделан вывод о возможности перехода хламидий в ходе инфекционного процесса в некультивируемое состояние. В этом состоянии хламидии продолжают вызывать воспаление или персистируют в клетках эпителия, но не выявляются микробиологическим методом (6).

В настоящее время накоплен очень большой материал, свидетельствующий об актуальности молекулярной диагностики, но мы не можем рассматривать другие примеры в силу ограниченности объёма данной публикации.

Стратегия использования методов лабораторной диагностики

На современном этапе развития лабораторной диагностики инфекционных заболеваний очевидна необходимость комплексного подхода, который заключается в использовании различных лабораторных методов для установления этиологического диагноза инфекционного заболевания. Врач решает вопрос об использовании того или иного метода лабораторных исследований после изучения анамнеза и клинических проявлений. Разные сочетания методов используют в зависимости от особенностей биологии возбудителей и их взаимодействия с иммунной системой человека, а также от формы заболевания.

Например, для лабораторной диагностики хламидий, вирусов герпес-группы, токсоплазм анализируют результаты ПЦР- и ИФА-исследований. А при лабораторной диагностике микоплазмоза и уреаплазмоза используют сочетание ПЦР с выделением культур с определением чувствительности к антибиотикам. Для выявления неспецифической условно-патогенной микрофлоры используют микроскопию мазка и микробиологический метод выделения культур.

Врач-клиницист ставит диагноз на основании изучения анамнеза пациента, клинических проявлений и данных лабораторной диагностики.

Литература:

Инфекции, передаваемые половым путем, №2, стр. 21-24, 2002 год. Урогенитальная хламидийная инфекция. Подходы к диагностике и терапии. Г.А. Дмитриев, ЦНИКВИ МЗ РФ, Москва.
Учебное пособие. Всероссийский учебно-научно-методический центр по непрерывному медицинскому и фармацевтическому образованию. Москва, 1999 год. Микроэкология влагалища. Коррекция микрофлоры при вагинальных дисбактериозах. В.М. Коршунов,…Л.И. Кафарская,…В.В. Смеянов. МЗ РФ, РГМУ, МИМСР, РМАПО, Москва.
Инфекции, передаваемые половым путем, №1, стр. 8-15, 2002 год. Современное состояние вопроса о значении Ureaplasma urealiticum в генезе урогенитальных заболеваний. В.И. Кисина, О.С. Загребина, К.И. Забиров, В.В. Мешков. ЦНИКВИ МЗ РФ, ГКБ №47 МЗ, Москва.
Канцерогенез. Коллекив авторов под редакцией Д.Г. Заридзе. Научный мир, 2000 год, Москва. Вирусы папиллом и их роль в канцерогенезе шейки матки. Ф.Л. Киселев. Онкологический Научный Центр РАМН.
Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы). Справочник, под редакцией проф.А.И. Карпищенко, 2001 год, «Интермедика», Санкт-Петербург.
Infect. Immun., May 1992, 2040-2047, Vol 60, No. 5. Demonstration of chlamydial RNA and DNA during a culture-negative state. SM Holland, … HR Taylor. Division of Infectious Diseases, Johns Hopkins Hospital, Baltimore, Maryland.

Все чаще в медицинской практике стали применять новый метод диагностики инфекционных заболеваний, который имеет аббревиатуру ПЦР. В чем заключается сущность такого метода исследования и какие заболевания можно благодаря ему выявить, а также в чем достоинства ПЦР в сравнении с другими распространенными способами диагностики и как правильно подготовиться к анализу, можно узнать, прочитав данную статью.

Что такое ПЦР?

Аббревиатура ПЦР расшифровывается как полимеразная цепная реакция. Это возможность участка ДНК пропорционально приумножаться при необходимых условиях. Изобретена ПЦР-диагностика инфекций еще в 1980-х годах. Работали над открытием европейские, американские и советские ученые, поэтому определить первоизобретателя инновационного диагностического метода не представляется возможным. Кроме того, начиная с 1983 года, когда был официально зарегистрирован такой метод исследования инфекционных заболеваний, как ПЦР, продолжается работа по усовершенствованию данного способа. На сегодняшний день такой метод диагностики применяют практически в каждой медицинской лаборатории, имеющей современное необходимое оборудование.

Как происходит анализ?

Для анализа ПЦР, в зависимости от медицинских показаний, необходимо провести медицинский забор таких материалов, как кровь, слюна, моча, сперма, грудное молоко или половые выделения, эпителиальные клетки. Диагностика инфекций методом ПЦР заключается в том, чтобы обнаружить ДНК возбудителя в исследуемом материале. С помощью специальных лабораторных манипуляций с использованием химических реактивов и оборудования лаборанты проводят полимеразную цепную реакцию. С ее помощью незаметный в микроскоп участок ДНК возбудителя разрастается до заметных в прибор размеров. Именно поэтому можно обнаружить возбудителя инфекции даже при наличии незначительного участка его ДНК в исследуемом материале.

Какие инфекции можно обнаружить методом ПЦР?

Способна обнаружить целый ряд патогенных микроорганизмов ПЦР-диагностика инфекций. Расшифровка результатов сводится к обнаружению возбудителя и определению его вида. С помощью полимеразной цепной реакции диагностируют различные заболевания человека: от передающихся половым путем до бессимптомных, так называемых скрытых инфекций. С помощью ПЦР находят:

вирус гепатита (А, В, С);
уреплазму уреалитикум;
уреплазму парвум;
хламидию трахоматис;
кандиду;
микоплазму хоминис;
микоплазму гениталиум;
гарганеллу вагиналис;
трихомоназ;
микобактерию туберкулеза;
вирус герпеса простого 1 и 2 типа;
вирус папилломы;
вирус Эпшетейна-Барра;
хеликобактер пилори;
вирус иммунодефицита.

Вышеперечисленные микроорганизмы вызывают такие заболевания, как гепатит, туберкулез, ИППП и СПИД.

ПЦР-диагностика инфекций проводится в виде качественного (то есть определяют наличие или отсутствие возбудителя) и количественного анализа (высчитывают количество микроба в организме - такой подход необходим, например, при диагностике ВИЧ-инфекций и гепатита).

Достоинства диагностического метода

Практически в каждой лаборатории сегодня проводят диагностику инфекций человека с помощью полимеразной цепной реакции. В чем же достоинства такого метода, почему он стал невероятно популярным как среди медиков, так и в среде пациентов за такой короткий промежуток времени? Объясняется такое стремительное распространение инновационной технологии высоким уровнем достоверности, эффективности и чувствительности. Рассмотрим подробнее достоинства метода диагностики ПЦР:

Процесс проведения анализа максимально автоматизирован, что исключает человеческий фактор при проведении исследования и расшифровке результата.
Благодаря современным технологиям культуры выращиваются в течение 4-6 часов, а соответственно, получить результат анализа можно в день сдачи материала для исследования.
ПЦР-диагностика инфекций обладает высокой чувствительностью, что позволяет обнаружить возбудителя даже при наличии незначительного участка ДНК. В некоторых случаях, например, при вялотекущих и бессимптомных заболеваниях, посев культур иным методом является затруднительным или полностью невозможным.
Материалом для исследования методом ПЦР могут стать кровь, слюна, урогенитальные выделения, эпителиальные клетки, моча, сперма, что крайне удобно при невозможности взятия для анализа определенного материала. Для диагностики инфекционных заболеваний обычно используют венозную кровь и урогенитальный мазок.
Методом полимеразной цепной реакции можно определить несколько возбудителей из одного материала. Такой подход не только сокращает время для постановления правильного диагноза, но и экономит затраты на исследование.
Метод ПЦР считается достоверным, так как было отмечено лишь небольшое количество ложноотрицательных результатов. Ложноположительных ответов зафиксировано до сегодняшнего дня не было.

Когда применяют ПЦР-диагностику?

Какими бы достоинствами ни обладала ПЦР-диагностика инфекций, применяют такой метод не всегда. Например, при диагностике токсоплазмоза полимеразную цепную реакцию проводят только в том случае, если анализ ИФА показал сомнительный или спорный результат. С помощью метода ПЦР невозможно проследить динамику заболевания. Отметим следующие случаи, когда данный метод исследования принесет достоверные и эффективные результаты:

для определения инфекционных заболеваний, указанных выше, в соответствующем разделе статьи;
широко распространена ПЦР-диагностика урогенитальных инфекций;
для определения ИППП во время беременности;
для диагностики ВИЧ;
при спорных медицинских ситуациях для подтверждения или опровержения предварительного диагноза;
для определения отцовства и родственных связей;
применяют в генотипировании для обнаружения наследственных предрасположенностей;
помогает метод ПЦР работникам криминалистического отдела медицины для идентификации генетического материала.

ПЦР во время беременности

Обследование ПЦР-методом назначается в обязательном порядке беременной женщине при постановке на учет с целью ранней диагностики инфекций, передающихся половым путем. Так как такие заболевания крайне опасны для нормального протекания периода вынашивания ребенка. ИППП провоцируют замирание развитие плода, выкидыши, внутриутробные уродства, мертворождение, врожденные патологии. Своевременное обнаружение и лечение инфекции значительно повышают шансы на благоприятный исход беременности и рождение здорового малыша.

Обычно будущей маме назначается комплексное обследование, которое имеет название «ПЦР 6». Такое исследование включает анализ на 6 разных инфекций. Проводится как в государственных, так и в частных учреждениях ПЦР-диагностика: «Инвитро», «Счастливая семья», «Уро-Про» и другие лаборатории предлагают такую услугу. Более подробно этот вопрос описан ниже.

Таким образом, понадобится лишь один раз провести забор материала для анализа. При проведении ПЦР-диагностики во время беременности необходим урогенитальный мазок, который берется из канала шейки матки гинекологической щеточкой. Такая процедура не вызывает болезненных ощущений у беременной и никак не влияет на плод.

ПЦР для определения гепатита

Часто назначают ПЦР-диагностику для обнаружения возбудителя гепатита. Объясняется это тем, что такое заболевание нередко протекает бессимптомно и переходит в хроническую тяжелую трудноизлечимую стадию. С помощью ПЦР определяют гепатит на самых ранних этапах, что способствует благоприятному излечению в максимально короткие сроки. Проводится в большинстве частных лабораторий такая ПЦР-диагностика инфекций. Цена зависит от типа определяемого вируса и вида анализа. Так, простое определение наличия или отсутствия ДНК возбудителя в крови стоит 400-600 р. Количественный метод обойдется в 1200-1500 р.

Комплексное исследование методом ПЦР

Для еще более эффективной результативности метода ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний широко применяют комплексное исследование, которое способствует сокращению сроков постановки диагноза и своевременному лечению. Так, лаборатории предлагают анализ «ПЦР-6» и «ПЦР-12». В первый комплекс входит ПЦР-диагностика половых инфекций, таких как:

уреплазмоз;
хламидиоз;
микоплазмоз;
папилломавирус человека;
простой герпес;
цитомегаловирус.

Такое исследование часто назначается женщинам на ранних сроках беременности, а также в период планирования зачатия.

При проведении «ПЦР-12», помимо вышеуказанных заболеваний, диагностируют следующие:

гонорею;
кандидоз;
бактериальный вагиноз;
трихомониаз;
уреплазмоз;
герпес 1 и 2 типа.

В зависимости от лаборатории, перечень исследуемых заболеваний, входящих в комплекс, может различаться. Врач подберет в каждом конкретном случае наиболее подходящий вариант обследования. В любом случае комплексный анализ методом ПЦР займет гораздо меньше времени, сил и материальных затрат.

ПЦР-диагностика инфекций: как сдавать?

Подготовка к анализу методом ПЦР заключается в соблюдении рекомендаций по забору определенного вида материала:

Сдавая урогенитальный мазок, следует воздержаться от полового контакта за трое суток до предполагаемого анализа, прекратить прием антибактериальных препаратов и местных мазей, кремов, свеч, нельзя проводить процедуру спринцевания. Во время менструальных выделений забор материала не проводится - необходимо провести анализ не ранее, чем через 3 дня после завершения менструаций. Следует воздержаться от мочеиспускания за 3 часа до анализа.
Венозную кровь лучше сдавать с утра, натощак (хотя это не является правилом). Накануне следует ограничить употребление алкоголя и жирной пищи.
При сдаче спермы необходимо воздерживаться от полового контакта трое суток. Рекомендуется ограничить употребление спиртного, посещение сауны, прием горячей ванны.
Мочу следует сдавать утреннюю, предварительно проведя тщательный туалет половых органов. Лучше собирать материал в специальную стерильную емкость. Материал следует доставить в лабораторию в течение нескольких часов.

Как расшифровать результат?

Не вызывает сложностей интерпретация результатов, после того как была проведена ПЦР-диагностика инфекций. Расшифровка качественного метода заключается в оценке наличия или отсутствия в исследуемом материале возбудителя, а также в определении вида патогенного микроорганизма. Если в исследуемом материале был обнаружен участок ДНК микроба, то записывается положительный результат на соответствующем бланке, а также указывается, какой именно вид микроба был определен. При отсутствии патогенного микроорганизма в материале результат будет отрицательным.

Полученные результаты количественного анализа, например при диагностике гепатита, необходимо расшифровывать с помощью норм, указанных лабораторией. Так как единицы измерения и количественный фактор значительно отличаются в разных медицинских диагностических учреждениях. Достоверно, с учетом всех сопутствующих факторов, расшифровать такой анализ может только врач.

Метод ПЦР (полимеразная цепная реакция) – «золотой стандарт» современной ДНК- диагностики, высокочувствительный метод молекулярной биологии. используется в медицине, генетике, криминалистике и других областях. Он часто и успешно применяется в диагностике многих инфекционных заболеваний.

Диагностика инфекционных заболеваний методом ПЦР

Исследование методом ПЦР позволяет обнаружить в исследуемом материале не только самого возбудителя, но даже единственный фрагмент чужеродной ДНК. Исследуемым (биологическим) материалом выступает: венозная кровь, эпителиальные клетки и секрет половых путей, сперма, слюна, мокрота и другие биологические выделения. Необходимый биологический материал определяется предполагаемым заболеванием.

Метод ПЦР в наше время, безусловно, является мощным диагностическим инструментом. Пожалуй, единственным минусом исследования является его высокая цена.

В перечне заболеваний, наличие которых можно определить методом ПЦР присутствуют:

вирусные и бактериальные пневмонии;
туберкулез;
корь, краснуха, паротит;
инфекционные гепатиты всех форм;
сальмонеллез, дифтерия;
хеликобактериоз и заболевания, вызванные кишечными инфекциями;
ЗППП (заболевания передающиеся половым путем): гонорея, хламидиоз, уреаплазмоз, сифилис, СПИД, генитальный герпес, гарднереллез и другие.

Обследование на ИППП методом ПЦР

В отличие от традиционных анализов методика ПЦР позволяет обнаружить инфекции передающиеся половым путем (ИППП) даже при полном отсутствии их признаков. Для забора биологического материала женщинам делают соскоб эпителиальных клеток канала шейки матки, мужчинам – соскоб уретры. При необходимости методом ПЦР проводится исследование венозной крови.

Таким образом, обследование на ИППП методом ПЦР дает возможность выявить:

вирус иммунодефицита человека (ВИЧ);
бледную трепонему (возбудителя сифилиса);
вирус простого герпеса и цитомегаловирус;
вирус папилломы человека (ВПЧ);
хламидии, токсоплазму, микоплазмы, уреаплазмы и другие половые инфекции.

При условии правильности проведения анализа методом ПЦР вероятность ложноположительных результатов исключается. Отдельно следует упомянуть о вирусе папилломы человека (ВПЧ) и о значении метода ПЦР для его диагностики. В отличие от онкоцитологического мазка методом ПЦР можно определить конкретный тип ВПЧ, в частности его онкогенные типы 16 и 18, наличие которых грозит женщине таким серьезным и часто смертельным заболеванием, как . Своевременное выявление онкогенных типов ВПЧ методом ПЦР нередко дает возможность предотвратить развитие цервикального рака.

Иммуноферментный анализ (ИФА) и метод полимеразной цепной реакции (ПЦР): плюсы и минусы

Какой диагностический метод лучше: ПЦР или ИФА? Правильного ответа на этот вопрос не существует, так как по сути своей диагностика с помощью этих двух исследований преследует разные цели. Причем чаще методы ИФА и ПЦР применяются в комплексе.

Исследование методом ПЦР необходимо для определения конкретного возбудителя инфекции, обнаружить его можно сразу после заражения, несмотря на отсутствие симптоматического проявления заболевания. Такой метод идеален для выявления скрытых и хронических бактериальных и вирусных инфекций. С его помощью можно выявить одновременно несколько возбудителей, а во время терапии метод ПЦР позволяет оценить ее качество за счет определения количества копий чужеродной ДНК.

В отличие от методики ПЦР метод ИФА призван обнаружить не самого возбудителя инфекции, а иммунный ответ организма на него, то есть выявить наличие и количество антител к определенному возбудителю. В зависимости от типа обнаруженных антител (IgM, IgА, IgG) можно определить стадию развития инфекционного процесса.

Оба метода и ПЦР, и ИФА обладают высокой достоверностью (100 и 90% соответственно). Но важно отметить тот факт, что анализ ИФА в некоторых случаях дает ложноположительный (если человек переболел определенным заболеванием в прошлом) или ложноотрицательный (если заражение прошло относительно недавно) результат.

На сегодняшний день анализ ПЦР считается одним из самых достоверных методов диагностики различных инфекционных заболеваний. К тому же метод становится всё более доступным. Благодаря высокому уровню специфичности исключается возможность получения ложных результатов.

Методика проведения анализа

Во время анализа исследуемый материал помещают в специальный прибор. Добавляют ферменты, которые участвуют в образовании генетического материала. Далее происходит многократное копирование ДНК или РНК возбудителя заболевания. От цикла к циклу число копий ДНК возрастает до количества, при котором легко идентифицировать возбудитель.

Анализ крови методом ПЦР наиболее часто используют в клинической практике для выявления инфекционной причины заболевания. Также возможно исследование мочи, мазка из зева и других биологических материалов. У женщин для анализа ПЦР используют выделения из половых органов, цервикального канала. При этом важно знать, как подготовиться к анализу ПЦР у женщин, чтобы результат был максимально достоверный. Главное соблюдать нижеперечисленные правила:

воздержание от половых актов в течение трех суток перед сдачей анализов;
большая часть бактерий может «вымыться» с мочой, поэтому не следует мочиться перед исследованием;
не проводить исследование сразу после менструации, необходимо подождать 3-5 дней после ее окончания.

Перед анализом крови особой подготовки нет.

ПЦР – что показывает анализ?

Известно, что анализ ПЦР показывает наличие различных вирусных и бактериальных инфекций. Данный метод также эффективен для выявления скрытых, хронических инфекций. Анализ на ИППП методом ПЦР дает возможность выделить патогенный агент даже при наличии единичных клеток вирусов и бактерий. Стоит отметить, какие анализы ПЦР входят в блок генитальных инфекций, это:

хламидия;
уреаплазмы (парвум и уреалитикум);
возбудитель гонореи;
различные типы вируса папилломы человека;
трихомонады;
гарднереллы;
кандида.

При инфекционных заболеваниях половых органов материалом для ПЦР служит мазок из цервикального канала, уретры и влагалища. К подготовке к зачатию следует подходить с большой ответственностью. При планировании беременности необходимы анализы ПЦР в случае, когда есть подозрения на наиболее распространенные инфекционные заболевания. А при наличии инфицированности беременность лучше отложить. Стоит отметить, что анализы на выявление вышеперечисленных возбудителей необходимо сдать не только женщине, но и мужчине.

Также метод ПЦР позволяет выявить следующие возбудители:

вирусы гепатита В и С;
микобактерии туберкулеза;
вирусы семейства герпес, в том числе вирус Эпштейн-Барр и цитомегаловирус;
хеликобактерная инфекция.

Интерпретация результатов

Расшифровка анализа ПЦР не вызывает сложностей. Обычно результаты анализов ПЦР можно получить следующие:

В некоторых случаях производят количественное определение микроорганизмов. Это особенно актуально при заболеваниях, вызванных условно-патогенными микроорганизмами. Так как данные бактерии проявляют свое негативное воздействие лишь при избыточном количестве. Также количественный анализ ПЦР важен для выбора терапевтической тактики и с целью контроля над лечением таких вирусных инфекций, как ВИЧ и вирусы гепатита.